BIOAKTIVITAS SENYAWA FLAVONOID

Flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa metabolit sekunder yang paling  banyak  ditemukan  di  dalam  jaringan  tanaman  (Rajalakshmi  dan  S. Narasimhan, 1985). Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa phenolik dengan struktur  kimia  C 6 -C 3 -C 6   (White  dan  Y.  Xing,  1951;  Madhavi  et  al.,  1985; Maslarova,  2001)  (Gambar  1).    Kerangka  flavonoid  terdiri  atas  satu  cincin aromatik  A,  satu  cincin  aromatik  B,  dan  cincin  tengah  berupa  heterosiklik  yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya (Hess, tt). Sistem penomoran digunakan untuk  membedakan  posisi  karbon  di  sekitar  molekulnya  (Cook  dan  S.  Samman, 1996). Berbagai  jenis  senyawa,  kandungan  dan  aktivitas  antioksidatif  flavonoid sebagai salah satu kelompok antioksidan alami yang terdapat pada sereal, sayur-sayuran  dan  buah,  telah  banyak  dipublikasikan.  Flavonoid  berperan  sebagai antioksidan  dengan  cara  mendonasikan  atom  hidrogennya  atau  melalui kemampuannya  mengkelat  logam,  berada  dalam  bentuk  glukosida  (mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon (Cuppett et al.,1954).

                             

                 Gambar 1.   Kerangka C 6  – C 3  – C 6  Flavonoid

Pada  sorgum  yang  diekstraksi  dengan  metanol,  didapatkan  tiga jenis anthocyanogen  flavonoid,  satu  jenis  merupakan  flavonone  (kemungkinan eriodictyol)  dan  sisanya  adalah  anthocyanidin  (pelargonidin)  (Yumatsu  et  al., 1965).    Narasimhan  et  al.  (1988,  1989)  melaporkan  bahwa  telah  ditemukan komponen aktif dari ekstrak kulit gabah dua kultivar padi, Katakura (Oryza sativa Linn,  var.  Indica;  berumur  panjang)  dan  Kusabue  (Oryza  sativa  Linn,  var. Japonica;  berumur  pendek),  berupa  substansi  flavonoid  dan  salah  satunya diidentifikasi sebagai isovitexin, yaitu senyawa C-glycosil flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan sebanding dengan tokoferol.  Kemudian oleh Osawa et al. (1992) telah diisolasi suatu senyawa flavonoid baru dari daun green barley muda (Hordeum  vulgare  L.  var.  nudum  Hook)  yang  diidentifikasi  sebagai  2’’-O-Glycosylisovitexin (2’’-O-GIV). Berdasarkan pengujian dengan sistem peroksidasi A.  Redha  – Flavanoid: Struktur, Sifat  ... 198 lipid,  100 M  senyawa  2’’-O-GIV  pada  pH  7,4  dalam  kondisi  irradiasi  UV, mampu menekan pembentukan 40% malonaldehyde (tidak berbeda nyata dengan tokoferol pada konsentrasi yang sama)  (Kitta et al., 1992). Sedangkan vitexin dan  isovitexin  yang  diisolasi  dari  ekstrak  kulit  gabah  buckwheat  (Fagopyrum esculentum  Moench)  tidak  menunjukkan  aktivitasnya  sebagai  peroxy  radical scavenger (Watanabe et al., 1997).

Hasil penelitian lainnya menunjukkan bahwa kadar  flavonoid  terikat  pada  jagung,  gandum,  oat  dan  padi  relatif  lebih  tinggi dibandingkan dengan  kadar flavonoid dalam bentuk bebasnya (Adom dan Rui Hai Liu, 2002) (Gambar 2). Bentuk flavonoid terikat memiliki koefisien korelasi yang nyata terhadap aktivitas antioksidan total (r 2  = 0,925).  

Dalam  upaya  mengoptimasi  metode  penentuan  kuantitatif  flavonoid  dengan HPLC, Hertog et al. (1992a) telah mendapatkan beberapa senyawa flavonoid yang berpotensi  sebagai  anti-karsinogenik  dari  sejumlah  sayuran  dan  buah  (Tabel  1). 

Produk	Senyawa Flavonoid	Kandungan (mg/kg berat segar)
Lettuce (Lactuca sativa L)	Quercetin	9
Leek (Allium porrum L)	Kaempferol Quercetin	31 2
Onion (Allium cepa L)	Kaempferol Quercetin	544 < 2,5
Cranberry(Vaccinium  macrocarpon Ait)	Kaempferol Myricetin Kaempferol	172 77 18
Endive (Chicorium endivia L)	Apigenin	108
Seledri (Apium graveolens L)	Luteolin	22

Pada penelitian lanjut (Hertog et al., 1993) diketahui pula adanya senyawa-senyawa flavonoid seperti quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin dan luteolin pada  12  jenis  teh,  6  jenis  minuman  anggur  dan  7  macam  jus  buah  yang  biasa dijumpai pada pusat-pusat perbelanjaan di Belanda.

Permasalahan:

1.      Bagaimanakah pengaruh gugus dari masing-masing senyawa golongan flavonoid sehingga memiliki bioaktivitas yang beragam?

2.      Lalu, apakah bioaktivitas senyawa flavonoid yang terikat berbeda dengan bioaktivitas senyawa flavonoid bebas?

ISOLASI DAN PEMURNIAN SENYAWA ALKALOID DARI DAUN SIDAGURI

Prosedur Penelitian

a   Uji  Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa alkaloid yang terdapat dalam daun sidaguri , maka dilakukan uji pendahuluan penapisan golongan kimia ekstrak daun tersebut (Soetarno dan Soediro, 1997; Depkes RI, 2000) yaitu:

Uji Alkaloid

• Dengan plat KLT, dimana pada plat ditotolkan ekstrak, lalu disemprotkan dengan  reagen Dragendrof. Apabila ada noda yang naik dan memberikan perubahan warna menjadi orange atau merah, diduga positif alkaloid. 

•  Dengan metoda “Culvoner Fitgerld”, daun segar sebanyak 4 gram dirajang halus, dibasahi dengan sedikit alkohol, kemudian ditambahkan sedikit pasir lalu digerus. Ditambahkan  10 mL kloroform amoniak 0,05N, digerus lagi. Disaring dengan kapas, lalu diambil dengan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi besar, ditambahkan 5 ml H₂SO₄ 2N lalu dikocok. Lapisan asam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan satu tetes reagen mayer . Apabila terbentuk endapan putih berarti positif alkaloid.

b     Ekstraksi dan Fraksinasi

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi dimana serbuk daun sidaguri  sebanyak 1 kg dimaserasi dengan methanol (3  x 5 L) pada temperatur kamar dan disaring lalu pelarut diuapkan dari ekstrak methanol dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat methanol. Terhadap ekstrak  pekat methanol  inni dilakukan partisi cair-cair dengan n- heksana. Masing- masing ekstrak dipekatkan kembali dengan rotary evaporator sehingga diperoleh residu kering dan dilanjutkan dengan uji skrining fitokimia.. Ekstrak methanol ditambahkan HCl 2M hingga mencapai Ph 2 dan didiamkan selama 24 jam, kemudian dicuci dengan dietileter. Selanjutnya ditambahkan NH₄OH pekat sampai    pH 9-10, diekstraksi dengan dietil eter dan ekstrak dietileter tersebut diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak pekat dietileter

c    Pemisahan dan Pemurnian

Dari hasil skrining fitokimia dengan mengggunakan reagen mayer dan reagen dragendrof terhadap ekstrak dietileter daun sidaguri menunjukkan bahwa daun tumbuhan tersebut mengandung senyawa alkaloid.

Ekstrak pekat dietileter yang mengandung senyawa alkaloid kemudian dipisahkan dengan menggunakan kromatografi kolom. Sebelum dilakukan kromatografi kolom, terlebih dahulu terhadap fraksi dietileter tersebut diilakukan uji KLT analitik untuk menentukan jenis eluen yang memiliki pola pemisahan paling baik yang akan digunakan pada kromatografi kolom.

Komposisi pelarut ditentukan berdasarkan pendekatan KLT. Isolasi senyawa alkaloid dari daun sidaguri dilakukan dengsn metode kkromatografi kolom menggunakan silica gel 60 sebagai fasa diam dan kloroform : methanol  sebgai fasa gerak berdasarkan teknik “step gradient polarity”. Eluen yang digunakan adalah kloroform; metanol dengan nilai perbandingan sebgai berikut( 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 40:60). Eluen ditampung dalam botol- otol vial 5 ml dan diannalisis dengan KLT. Fraksi-fraksi yang memilii spot dengan nilai Rf sama digabung dan pelarutnya diuapkan, selanjutnya diloakukan pemurnian.

HASIL DAN PEMBAHASAN

     Hasil maserasi 1 kg serbuk daun sidaguri dengan pelarut metanol didapatkan ekstrak kasar metanol sebannyak 120 gram, berbentnuk cairan kental. Ekstrakk metanol ini dipartisi dengan campuran pelarut n- heksana dan air (1:1). Hal ini dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa polar dan senyawa nonpolar. Masing-masing ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak  pekat metanol sebanyak 73 gram setelah diekstraksi dengan dietileter sebanyak 45 gram.

      Berdasarkan uji KLT terhadap ekstrak dietileter maka didapatkan pola pemisahan yang paling baik adalah kloroform : metanol dengan perbandingan (7:3). Tujuan dari mendapatkan identitas noda dengan harga Rf pada uji KLT adalah untuk mencarii pelarut yang akan digunakan pada kromatografi kolom(Markham, 1998).

    Isolasi senyawa alkaloid dari daun sidaguri dilakukan dengan metode kromatografi kolom menggunakan silica gel 60 sebagai fasa diam dan kloroform : metanol sebagai fasa gerak berdasarkan teknik  “ step gradient polarity” agar senyawa-senyawa terpisah berdasarkan derajat kepolarannya.

     Hasil kromatografi kolom diperoleh sebanyak 117 fraksi, kemudian dilakukan penggaabungan fraksi-fraksi  berdasarkan uji KLT dengan melihat nilai Rf. Fraksi-frkasi yang memiliki spot dengan nilai Rf yang sama digabung sehingga didapat 5 fraksi dan pelarutnya diuapkan.

       Dari kelima fraksi tersebut dilakukan skrinning fitokimia dan fraksi 2 dan 4 menun jukkan hasil positif mengandung senyawa alkaloid. Dalam peneitian ini hanya frakssi 2 yang dilakukan analisis lebih lanjut. Terhadap fraksi 2 tersebut dilakukan pemurnian dan diperoleh padatan berwarna kecoklatan sebanyak 59 mg. Berdasarkan hasil uji kelarutan senyawa ini memiliki kelarutan yang besar dalam kloroform dan dari haasil KLT dengan menggunakan penampak noda reagent dragendrof diperoleh noda tunggal.

Permasalahan:

Mengapa pada tahap awal proses isolasi alkaloid setelah penambahan reagen cenderung lebih mengutamakan kegiatan  penambahan asam kemudian juga ditambahkan sebuah basa dengan ketentuan hingga pH tertentu? Selain itu,  selama proses isolasi maupun setelahnya seringkali terjadi dekomposisi yang disebabkan oleh sifat kebasaannya terutama oleh panas dan sinar dengan adanya oksigen.  Hasil dari reaksi  ini  sering  berupa  N-oksida. Namun, hal ini dapat dicegah dengan  Pembentukan  garam  dengan  senyawa  organik  (tartarat,  sitrat)  atau  anorganik  (asam  hidroklorida  atau  sulfat).  Yang ingin saya tanyakan bagaimanakah mekanisme pencegahannya tersebut ? ? ?